大鼠原代角膜成纖維細(xì)胞的操作需嚴(yán)格遵循無菌原則、培養(yǎng)條件控制及質(zhì)量保障規(guī)范，以確保細(xì)胞活性與實(shí)驗(yàn)可靠性。

?一、樣本處理階段?
?取材與消毒?

取材后立即用含雙抗（青霉素+鏈霉素）的PBS沖洗5次以上，去除血污及雜質(zhì)?。
角膜組織需在體視顯微鏡下精細(xì)修剪，避免殘留結(jié)締組織或上皮細(xì)胞污染?。
?組織消化?

推薦使用IV型膠原酶（37℃震蕩消化60分鐘）而非胰酶，減少對角膜基質(zhì)細(xì)胞的損傷?。
消化后需用巴氏吸管輕柔吹打，避免過度機(jī)械剪切導(dǎo)致細(xì)胞碎片增多?。
?二、細(xì)胞培養(yǎng)階段?
?接種與貼壁?

培養(yǎng)皿需預(yù)包被鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）或多聚賴氨酸（0.1mg/mL），增強(qiáng)細(xì)胞貼壁性?。
接種密度建議為2×10? cells/mL，避免過高密度導(dǎo)致營養(yǎng)競爭?。
?培養(yǎng)基選擇?

使用含10%-20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，血清批次需提前驗(yàn)證穩(wěn)定性?。
每2-3天換液，首次換液在接種后3天進(jìn)行，避免過早干擾細(xì)胞貼壁?。
?三、傳代與凍存?
?傳代時機(jī)?

細(xì)胞融合度達(dá)80%時需傳代，超過90%易導(dǎo)致接觸抑制和老化?。
消化時間控制在1-3分鐘（0.25%胰酶），顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓后立即終止?。
?凍存保護(hù)?

凍存液需含10% DMSO+90%胎牛血清，程序降溫（-1℃/min）至-80℃后轉(zhuǎn)液氮?。
?四、污染與質(zhì)量控制?
?無菌操作?

超凈臺紫外照射30分鐘后操作，所有器械需酒精燈灼燒滅菌?。
定期檢測支原體（建議每2代檢測一次）?。
?細(xì)胞鑒定?

通過α-SMA免疫熒光染色或膠原合成功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞純度?。
?五、常見問題處理?
?貼壁不良?：檢查包被條件或血清批次，必要時更換培養(yǎng)基?。

?污染?：立即丟棄污染樣本，徹底消毒培養(yǎng)箱及操作臺?。

?六、注意事項(xiàng)?
原代細(xì)胞傳代不超過5代，3代內(nèi)狀態(tài)最佳?。
避免反復(fù)凍融，凍存后細(xì)胞活性需通過臺盼藍(lán)染色驗(yàn)證（存活率＞90%）?。
培養(yǎng)操作注意事項(xiàng)
七、無菌操作要求
使用大鼠角膜成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基時，需全程保持無菌環(huán)境，操作前對超凈臺、培養(yǎng)瓶及工具進(jìn)行消毒，避免污染影響細(xì)胞狀態(tài)。
培養(yǎng)基與環(huán)境控制
培養(yǎng)基不宜長時間暴露于室溫或高溫環(huán)境，凍融后若出現(xiàn)少量絮狀物，不影響使用，但需確保在保質(zhì)期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品必須廢棄。細(xì)胞培養(yǎng)需維持37°C、5%CO?的恒溫恒濕環(huán)境，新鮮細(xì)胞收到后應(yīng)立即放入培養(yǎng)箱靜置2-3小時穩(wěn)定狀態(tài)。
細(xì)胞復(fù)蘇與傳代流程
凍存細(xì)胞復(fù)蘇時，需37°C水浴快速解凍，解凍后加入5ml培養(yǎng)基重懸，1000rpm離心5分鐘，棄上清后轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；傳代時待細(xì)胞融合至80%，用PBS清洗后，以0.05%胰酶-EDTA消化，鏡下觀察細(xì)胞變圓后加入終止液終止，離心后分瓶。